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生物催化是利用微生物代謝過(guò)程中產(chǎn)生的酶催化合成各種新的化合物和天然產(chǎn)物的過(guò)程。由于生物催化反應(yīng)簡(jiǎn)單易行和高效的特點(diǎn)，近來(lái)十多年，生物催化劑在有機(jī)合成中應(yīng)用的數(shù)量快速的增加，特別是對(duì)于手性化合物的合成。在它們中間，醇脫氫酶（alcohol dehydrogenases，ADH，EC1.1.1.1）成為了焦點(diǎn)，它是一種氧化還原酶，在催化反應(yīng)中具有很高的立體和區(qū)域選擇性，能催化還原一系列潛手性的酮酯轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的手性醇，而后者是合成藥物，農(nóng)用化學(xué)品，芳香劑的重要手性砌塊。 在生物催化反應(yīng)中，使用游離的酶作生物催化劑，反應(yīng)活性很高，但是反應(yīng)產(chǎn)物提取和分離的過(guò)程復(fù)雜。而通過(guò)固定化后，酶的穩(wěn)定性提高，產(chǎn)物易于分離，并且還可以反復(fù)使用，降低了生產(chǎn)成本。因此，近年來(lái)在生物技術(shù)中固定化成為了研究熱點(diǎn)。 固定化酶的方法很多，常用的有吸附法，共價(jià)結(jié)合法，包埋法；所用的材料包括了合成的有機(jī)聚合物，生物高分子聚合物，無(wú)機(jī)材料等。為了克服有機(jī)材料機(jī)械強(qiáng)度低，穩(wěn)定性差的不足，本文在參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，從透性化啤酒酵母細(xì)胞中提取醇脫氫酶，采用共價(jià)結(jié)合法，以衍生化的無(wú)機(jī)材料凹凸棒作為載體，固定化醇脫氫酶。 選擇凹凸棒（attapulgite，ATP）作為載體，利用了凹凸棒具有抗酸性，熱力學(xué)穩(wěn)定性和較高的機(jī)械強(qiáng)度的性能，來(lái)達(dá)到提高酶的pH，熱力學(xué)，操作和反復(fù)使用的穩(wěn)定性的目的。本文選擇了乙酰乙酸乙酯作為模型底物，用固定化醇脫氫酶作為生物催化劑，催化不對(duì)稱還原乙酰乙酸乙酯（ethyl acetoacetate，EOB）為S型的3-羥基-丁酸乙酯（ethyl（S）-3-hydroxy butyrate，（S）-EOB）；主要對(duì)透性化啤酒酵母提取醇脫氫酶的影響因素，固定化醇脫氫酶以及催化不對(duì)稱合成S型3-羥基-丁酸乙酯的條件進(jìn)行了研究；并且以游離和固定化醇脫氫酶的活性，不對(duì)稱還原反應(yīng)的產(chǎn)物的產(chǎn)率、對(duì)應(yīng)體過(guò)量值ee（enantiomeric excess）為指標(biāo)，考察了分離提取的醇脫氫酶和固定化醇脫氫酶的穩(wěn)定性，及其他因素對(duì)催化合成的影響。對(duì)透性化啤酒酵母中提取ADH的影響因素及提取的ADH穩(wěn)定性進(jìn)行了研究 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，分離提取醇脫氫酶的過(guò)程中，細(xì)胞量與緩沖液的比（W：v）5：20，在5℃，pH7.5磷酸緩沖液中超聲破碎細(xì)胞，加入的硫酸銨為35％，所提取的ADH酶的活性最高達(dá)到105U/ml。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，ADH粗提液的最適pH和溫度分別為7.0，25℃。通過(guò)紅外檢測(cè)，用氨基硅烷偶聯(lián)劑3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）對(duì)凹凸棒進(jìn)行衍生化處理，得到了硅烷衍生化的凹凸棒。 而制備固定化ADH中，最佳條件為：戊二醛的濃度0.5％，固定化溫度30℃，pH6.8。最后得到的固定化ADH酶的活性最高可以達(dá)到0.074U/mg。固定化ADH的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，與游離的ADH相比，固定化后ADH穩(wěn)定性有明顯提高，它的最適溫度與pH值分別為35℃，pH7.5；在水浴中震搖32h，仍熱保持原有活性的58％。 催化不對(duì)稱合成實(shí)驗(yàn)表明，在0.1M pH7.0的磷酸緩沖液中，反應(yīng)2個(gè)小時(shí)，產(chǎn)物產(chǎn)率可以達(dá)到88％，（S）-EHB的ee達(dá)到99.2％，固定化的ADH，經(jīng)8次循環(huán)使用后，活性仍保留42％。

    關(guān)鍵詞：
    醇脫氫酶 分離提取 凹凸棒載體 手性合成 生物催化劑 固定化ADH
    作者：
    趙泉
    學(xué)位授予單位：
    重慶醫(yī)科大學(xué)
    授予學(xué)位：
    碩士
    學(xué)科專業(yè)：
    生物制藥與生物醫(yī)用材料
    導(dǎo)師姓名：
    于明安
    學(xué)位年度：
    2009
    語(yǔ)種：
    中文
    分類號(hào)：
    Q554.9
    在線出版日期：
    2009年12月25日